Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para la diferenciación molecularListeria Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para la diferenciación molecularListeria Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para la diferenciación molecularListeria Ángela María Cardoso-Bernal1, Luisa Fernanda Ramón2, Raúl A. Poutou-Piñales1*, Ana K. Carrascal-Camacho2Diana Corina Zambrano3 *Editado por Alberto Acosta Fecha de recepción: 25-07-2013 Fecha de aceptación: 27-08-2013 Fecha de publicación en línea: 30-08-2013 Citar este artículo / Citar este artículo Cardozo-Bernal AM, Ramón LF, Poutou-Piñales RA, Carrascal-Camacho AK, Zambrano DC (2013) Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para diferenciación molecularListeria. universidad de ciencias18(2):203-222 doi:10.11144/Javeriana.SC18-2.egcp. Abstracto InformeListeria monocytogenesNo es obligatorio en la alimentación colombiana, sin embargo, se vigilan los alimentos considerados de alto riesgo y solo se reporta clínicamente el organismo como Gram positivo si causa meningitis.Listeria monocytogeneses un patógeno intracelular transmitido por los alimentos que causa listeriosis, una enfermedad mortal en humanos y animales. Los brotes mundiales de la enfermedad causan pérdidas humanas y económicas. Solo unos pocos estudios en Colombia han logrado identificar y serotipar molecularmente los aislados, lo que solo permite una distribución teórica de los serotipos por linaje. Esta revisión explica las características del patógeno, su importancia en la salud pública y la industria alimentaria, y proporciona una descripción general de PFGE-CHEF; identificación de protocolos de trabajo estándar y enzimas de restricción apropiadas para escindir el ADN. Encontramos que la combinación de enzimas,Xbal-AscI,A esto le siguió ApaI, que proporcionó los mejores resultados para distinguir los aislamientos al agruparlos por linaje y mostrar la variación intraserotipo. Además, encontramos que en varios países de América Latina, los resultados se analizaron utilizando PulseNet, lo que asegura la comparación de los patrones de PFGE en condiciones equivalentes. Palabras clave:Tipificación molecular; pedigrí; serotipo; Listeria. resumir En Colombia, avisoListeria monocytogenesEn alimentos, pero controlando alimentos de alto riesgo. Clínicamente, se informan como organismos Gram-positivos solo si causan meningitis.Listeria monocytogeneses un patógeno intracelular que se transmite a través de los alimentos y es fatal para humanos y animales, causando listeriosis; múltiples brotes de esta enfermedad en todo el mundo han causado pérdidas humanas y económicas. Pocos esfuerzos en Colombia han logrado identificar y serotipificar molecularmente los aislamientos, que teóricamente solo pueden distribuir serotipos en linajes. Esta revisión se limita a presentar las características del patógeno, su importancia en la salud pública y la industria alimentaria, la generalidad de PFGE-CHEF, identificando protocolos de trabajo estandarizados y enzimas de restricción apropiadas para escindir el ADN. encontraron que la combinación de enzimas XbaI-AscI seguida de ApaI fue la que dio mejores resultados en la diferenciación de los aislados; los agruparon por linaje; mostraron variación intraserotipo, en varios países de Latinoamérica, los resultados fueron analizados por PulseNet, esto garantiza comparación de patrones PFGE en igualdad de condiciones. Palabras clave:Tipificación molecular; pedigrí; serotipo; Listeria. resumir En Colombia no existe notificación obligatoriaListeria monocytogenesEn alimentos, pero controlando alimentos de alto riesgo. Clínicamente, se informan como organismos Gram-positivos solo si causan meningitis.Listeria monocytogeneses un patógeno intracelular transmitido por los alimentos que es fatal para humanos y animales y causa listeriosis, con brotes en todo el mundo que causan pérdidas humanas y económicas. En Colombia se ha trabajado muy poco para caracterizar y serotipar molecularmente los aislamientos, lo que solo teóricamente permite la distribución de serotipos en linajes. La evaluación se limita a mostrar la caracterización del patógeno, su importancia en la salud pública y la industria alimentaria y una visión general de PFGE-CHEF; identificación de protocolos de trabajo estándar y enzimas de restricción apropiadas para escindir el ADN. descubrimiento de la unión de enzimasXbal-AscI, seguido de ApaI representa la combinación de enzimas que dio los mejores resultados en la diferenciación de los aislamientos, agrupados por linaje, mostrando variación intra-serotipo, y en muchos países de América Latina, los resultados fueron analizados por PulseNet, asegurando la comparación de los estándares PFGE en igualdad de condiciones. Palabras clave:Tipificación molecular; pedigrí; serotipo; Listeria. introducir Durante tres décadas, se ha informado que los alimentos listos para el consumo(listo para comer)es el medio más comúnListeria monocytogenes(Schlech et al. 1982, Rococurt 1996). En los Estados Unidos, se han informado brotes de listeriosis humana (enfermedad transmitida por los alimentos, FAD, causada por este organismo) en varios estados, asociados con el consumo de salchichas, queso y jamón (CDC 1999, CDC 2003). En países como Portugal, se ha encontrado que alrededor del 15% de los alimentos listos para el consumo están contaminadosListeria monocytogenes(Guerra et al. 2001, Mena et al. 2004). En Colombia, aunque los datos son escasos, se ha encontrado que este microorganismo está presente con una frecuencia del 24% en derivados cárnicos listos para el consumo (Vera et al., 2006). En 2008, la frecuencia fueListeria monocytogenes9,6% en leche cruda y 5,5% en queso (incluyendo cuajada) (Gallegos et al., 2008); más recientemente, las prevalencias encontradas en chorizo, jamón y chorizo fueron 4,0%, 6,13% y 7,69%, respectivamente (Gamboa-Marín et al. al., 2012). Esta revisión presenta miembros del género Listeria, que son específicos en que no todos son patógenos humanos o animales, dándoles las característicasListeria monocytogeneses un microorganismo que tiene un impacto económico adverso en la industria alimentaria y representa un riesgo para la salud pública. Por otro lado, considerando que cepas de un mismo serotipo pueden tener diferentes orígenes y diferente virulencia, se propuso la técnica de caracterización molecular CHEF variante PFGE, que utiliza enzimas de restricción específicas para cortar el ADN a baja frecuencia.Listeria monocytogenesSe demostró que la variación intra-serotipo es la mejor opción para agrupar los serotipos en linajes. Finalmente, se muestra en detalle el protocolo estandarizado PulseNet, por el cual muchos países alrededor del mundo están guiando la caracterización molecular.Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes (L. monocytogenes,patógenos humanos y animales) pertenecen al géneroListeriaEstos incluyen otras 9 especies,L. ivanovii(patógenos animales) y no patógenos,L. inocua、L. seeligeri, L. Welshimeri, L. Grayi, L. rocourtiae, L. fleischmannii, L. weihentephanensisSíLactobacillus martensi(Pirie 1940, Leclercq et al. 2009, Graves et al. 2010, den Bakker et al. 2013, Lang-Halter et al. 2013). El género se encuentra en ambientes como suelo, agua, zanjas de drenaje, vegetación, excrementos de vida silvestre, ensilaje, granjas e instalaciones de procesamiento de alimentos. Listeria monocytogenes,Es un microorganismo indeseable en la industria alimentaria por ser un potente contaminante (Assanta et al., 1990). Es un microorganismo Gram positivo, móvil, libre de esporas y anaerobio facultativo que puede sobrevivir a baja actividad de agua (aw), altas concentraciones de sal, y a temperaturas de -1 a 45 °C y a 4,3 Propagarse a valores de pH de 9 a 6 ± 0,2 (Todd y Notmans 2011). Además, es capaz de producirbiopelículaSe adhiere a diferentes superficies como vidrio, goma y acero inoxidable (Kalmokoff et al., 2001, Hassan et al., 2004), logrando así pasar todas las barreras diseñadas para patógenos en los alimentos (Lou et al., 2004). 1999, Gardan et al., 2003). Por otro lado, este microorganismo también presenta resistencia intrínseca a varios agentes antimicrobianos, lo que complica el tratamiento de pacientes con listeriosis (Ruiz-Bolivar et al. 2008, Ruiz-Bolivar et al. 2011b). Impacto de la listeriosis en la salud pública:infección causada porListeria monocytogenesSe conoce con el nombre de listeriosis y puede manifestarse de forma tanto invasiva como no invasiva. La listeriosis invasiva ocurre principalmente en grupos de edades extremas (recién nacidos y ancianos), mujeres embarazadas, personas con trastornos inmunosupresores y quienes reciben terapia inmunosupresora; en esta población, et al., se presentan meningitis, aborto espontáneo y sepsis, con una tasa de mortalidad de 20% a 30% (Rocourt 1996, Torres et al 2004, Torres et al 2005). Por otro lado, se ha observado listeriosis no invasiva en algunos brotes de origen alimentario, la mayoría de los cuales desarrollaron síntomas de gastroenteritis como diarrea, fiebre, dolor de cabeza y mialgia después de un breve período de incubación. La listeriosis no invasiva puede afectar a poblaciones enteras y la enfermedad suele resolverse espontáneamente (Dalton et al., 1997; Torres et al., 2004; Torres et al., 2005). La incidencia de listeriosis por ingestión de alimentos contaminados en Estados Unidos en 2007 destaca que el grupo con mayor número de aislamientos es el de los adultos mayores de 65 años, seguido de los niños menores de 5 años. Se han notificado un total de 1.557 casos confirmados, con una tasa de mortalidad superior al 20%. En Estados Unidos, los casos de listeriosis aumentaron entre 2003 y 2007, a diferencia de los informes de Francia entre 1999 y 2005, donde los casos aumentaron de 4,5 a 3,5 por millón de personas. Pero en 2006 aumentó a 4,7 casos por millón de habitantes. millones de habitantes; al igual que en Estados Unidos, el grupo de edad más afectado es el de mayores de 65 años (Todd & Notermans 2011). En Colombia existen pocos datos sobre la epidemiología de la listeriosis debido a que el organismo causante de la enfermedad no es necesariamente de declaración obligatoria y, cuando se presentan casos esporádicos, no se asocia a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA; Vanegas et al. 2009, Ruiz-Bolivar et al. ., 2011b). Sin embargo, los datos del tercer período epidemiológico de 2008 arrojaron 847 casos de ETA, con mayor incidencia en Bogotá, Antioquia, Magdalena, Cundinamarca y Boyacá, afectados por El grupo de edad más afectado es el de 15 a 44 años, con más más de 400 personas afectadas. (Grupo Funcional ETA-SVCSP-INS 2008). Por otro lado, no existen estadísticas oficiales y solo algunos informes: 1992, Hospital Central de la Policía de Bogotá (2 casos de listeriosis aguda supurativa y rombomeníngea; Sánchez et al., 1992); 1994, Hospital Universitario del Valle (Listeriosis en 3 neonatos; Payán & Astudillo 1994); en 1999 por la Fundación Clínica Valle del Lili (19 casos: 10 adultos inmunosuprimidos, 2 gestantes, 6 neonatos y 1 adolescente; Crespo et al., 1999), en 2001 por el Hospital Central de Policía de Bogotá (1 caso de listeriosis perinatal; Sánchez et al., 2001), en 2008 por la Universidad Libre de Cali (1 caso de listeriosis perinatal; Castillo-Cabezas & Paredes 2008), 2009 por el Hospital Pablo Tobón Uribe (1 caso de listeriosis pediátrica, Chávez et al., 2009); por lo que la pregunta aún no está claramente definida. Impacto económico de las ETAListeria monocytogenes:Las ETA tienen un enorme impacto económico; por ejemplo, los tratados de libre comercio aumentan el flujo de alimentos entre países, esto significa que la comercialización de alimentos contaminados puede inducir simultáneamente ATS en diferentes partes del planeta (Posfay-Barbe & Wald 2009) . Además del impacto en la salud pública, esto puede causar enormes pérdidas económicas debido a brotes de productos listos para el consumo, por ejemplo, en Canadá en 2008, una empresa de alimentos se vio obligada a recolectar alimentos contaminados de todas las tiendas, mercados callejeros y supermercados donde les vendían productos y tuvieron que invertir cerca de $27 millones en el proceso legal que tuvieron que enfrentar (Todd & Notermans 2011). Caracterización molecular de aisladosListeria monocytogenes:brote objetivoListeria monocytogenesNo parecen estar causados por la misma cepa o serotipo, por lo que la caracterización molecular de los aislados es una forma de distinguirlos o agruparlos (Lepe et al., 2012). En este sentido, es necesario utilizar métodos que permitan la distinción y tipificación de los aislados.Listeria monocytogenesde diferentes fuentes (Kérouanton et al., 2010), lo que facilita estudios epidemiológicos de salud pública e industrial, análisis de persistencia de ciertas cepas, análisis de riesgo, seguimiento y correlación de aislados (fuente de pacientes aislados). La presencia de datos de prevalencia de enfermedades humanas, animales o alimentarias subdiagnosticados en Colombia ha despertado el interés en el uso de técnicas moleculares rápidas, sensibles y específicas como la PCR.(reacción en cadena de la polimerasa),PCR cuantitativa(reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real/tiempo),área(análisis de enzimas de restricción),RAPD(amplificación aleatoria de ADN polimórfico)o ERIC-PCRLas enterobacterias repiten la reacción en cadena de la polimerasa de consenso entre genes),Para, entre otros, la identificación, serotipificación, caracterización bioquímica y molecular, y caracterización de susceptibilidad antimicrobiana de aislados nacionalesListeria monocytogenes(Cai & Kabuki 2002, Aguado et al. 2004, Vanegas et al. 2009, Ruiz-Bolivar et al. 2011a, Ruiz-Bolivar et al. 2011b, Gamboa-Marín et al. 2013). En otros países, la clasificaciónListeria monocytogenespor PFGE(Electroforesis en gel de campo pulsado),Rápidamente se ha vuelto útil para subtipificar aislamientos de diferentes fuentes (alimentos, medio ambiente, brotes en animales y humanos, etc.); Destro et al. 1996, Hunter & Gaston 1988, Autio et al. 1999, Johansson et al. 1999, Aarnisalo et al. . 2003, Kérouanton et al. 2010) porque la técnica permite el uso de enzimas de restricción para cortar el ADN genómico a baja frecuenciaListeria monocytogenesPor lo tanto, se generan perfiles simples (10 a 20 bandas) que facilitan el análisis y la comparación de resultados (Graves & Swaminathan 2001). En general, PFGE es una técnica que permite el aislamiento de fragmentos de ADN de alto peso molecular (10 Kb a 10 Mb; Nassonova 2008), que pueden utilizarse para rastrear e investigar brotes derivados de alimentos, así como para detectar estos debido al aumento de incidencia de ciertos subtipos A menudo se trata de brotes (Swaminathan 2001). Origen de la electroforesis en gel de campo pulsado:En 1984, Schwartz y Cantor idearon un método para aislar moléculas grandes de ADN (hasta 10 Mb); hasta la fecha, ha sido ampliamente aceptado y utilizado (Schwartz & Cantor 1984, Nassonova 2008). En este método, el ADN pasa a través de un gel de agarosa concentrado bajo la influencia de dos campos eléctricos. Los dos ángulos de campo eléctrico están cerca de la vertical, la intensidad del campo no es uniforme y cambia alternativamente (pulso). Generalmente se asume que a altas concentraciones de agarosa y alta tensión, las moléculas grandes de ADN deben alargarse en la dirección del campo eléctrico para penetrar los poros del gel. Cuanto más grande es la molécula de ADN, más tiempo puede encontrar nuevas orientaciones y permanecer en el gel (Southern et al. 1987). Tipos y variantes de electroforesis en gel de campo pulsado:El término original electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) fue utilizado por Schwartz y Cantor (1984) para cualquier separación de gel utilizando múltiples campos eléctricos alternos. Existen otras variantes de PFGE como: OFAGE(electroforesis en gel alternante de campo ortogonal;Carl y Olsen 1984), FIGA(Electroforesis en gel de inversión de campo;Carle et al., 1986, Birren & Lai 1993), TAFE(electroforesis de campo alterno horizontal;Garner et al. 1986, Nasonova 2008), Chef(campo eléctrico uniforme sujeto al contorno;Chu et al. 1986, Graves y Swaminathan 2001), PACE(electrodos programables de control autónomo;Birren y Lai 1993), RGE(electroforesis en gel giratorio;Sur, etc 1987), Academia China de Investigación Económica(electroforesis en gel de campo continuo;Birren y Lai 1993), ZIFE(Electroforesis de campo integral cero;Birren & Lai 1993) y ST/RIDE(electroforesis cruzada de inversión tangencial/rectangular síncrona;Birren & Lai 1993), lo que implica variaciones en las características y posibilidades del dispositivo (disposición geométrica de los electrodos, uniformidad, método y fuerza de campo de la reorientación del campo eléctrico) y posibles resultados obtenidos (velocidad de migración del ADN, tasa de resolución de bandas de ADN y muestra geometría del canal; Birren & Lai 1993). electroforesis en gel de campo pulsado(Electroforesis en gel de campo pulsado):En el dispositivo ideado por Schwartz y Cantor, el campo eléctrico varía a intervalos definidos formando un ángulo de 90° (Schwartz & Cantor 1984). En un gel rectangular, el campo eléctrico es uniforme, producido por dos filas de electrodos puntuales paralelos a lados opuestos del gel; el otro campo no es homogéneo, con una fila de electrodos puntuales actuando como cátodo y el electrodo opuesto actuando como ánodo producido . El sistema se llama "Electroforesis de gradiente de campo pulsado" (PFGE). En este sistema, el ángulo entre los vectores de fuerza de campo es diferente en diferentes regiones del gel (110°-150°), por lo tanto, moléculas del mismo tamaño migran a diferentes velocidades dependiendo de su posición inicial en el gel; esto complica la comparación de la movilidad electroforética del ADN que se encuentra en carriles adyacentes, lo que hace imposible calcular con precisión el tamaño molecular. Otros experimentos han demostrado que un campo no uniforme no es un requisito obligatorio para un aislamiento de ADN exitoso. Dado que la mayoría de los sistemas actuales se basan en campos uniformes, la abreviatura "PFGE" tiene una nueva interpretación (electroforesis en gel de campo pulsado; Nassonova 2008). Electroforesis de campo eléctrico uniforme con límites limitados(campo eléctrico uniforme sujeto al contorno):En este PFGE, se pulsa alternativamente un campo eléctrico generado por varios electrodos dispuestos a lo largo de un contorno hexagonal, lo que da como resultado un ángulo de reorientación del ADN de aproximadamente 120° (Figura 1Esta técnica tiene varias ventajas sobre las técnicas anteriores, tales como: mayor capacidad de separación (puede separar moléculas menores de 50 Kb y moléculas de hasta 2 Mb sin distorsión), las líneas de electroforesis son líneas perfectamente rectas, la separación El patrón es independiente de la posición del gel (Chu et al. 1986). Por lo tanto, la variante CHEF de PFGE es la variante utilizada en el protocolo de estandarización para la tipificación molecular.Listeria monocytogenes(Graves y Swaminathan 2001).
1Laboratorio de Biotecnología Molecular.
2Laboratorio de Microbiología de Alimentos. Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI). Departamento de Microbiología. Academia de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Distrito de Columbia.
3Asociación Colombiana de Porcicultores Agencia de Investigación y Transferencia de Tecnología - FNP-CENIPORCINO, Bogotá, Distrito de Columbia.
En un estudio multicéntrico promovido por la Organización Mundial de la Salud (Brosch et al., 1996), PFGE fue efectivo contra 80Listeria monocytogenesCon el fin de estandarizar el método más adecuado en el campo. Incluyó el tipo de PFGE y evaluó las variantes CHEF y FIGE, sin embargo, se obtuvieron diferencias consistentes y correlacionadas entre el resultado de las dos variantes de PFGE utilizadas (CHEF y FIGE). Aunque los geles pueden ser similares en ambas variantes porque las moléculas de ADN siguen canales rectos, hay dos diferencias fundamentales en la superioridad de CHEF sobre FIGE y otras variantes de PFGE: Primero, CHEF tiene una mayor capacidad de captación. Resolución hasta 7 Mb (genomaListeria monocytogeneses 2.9 Mb) a diferencia de FIGE, que tiene una alta resolución para moléculas entre 1 y 50 Kb; en segundo lugar, los dispositivos diseñados para la variante CHEF PFGE tienen la capacidad de aislar más muestras de ADN (~20) por ventaja de ejecución (Birren & Lai 1993).
Usos generales de la electroforesis en gel de campo pulsado en la epidemiología bacteriana:El PFGE ha demostrado ser una técnica altamente discriminatoria, por lo que se utiliza en estudios epidemiológicos de brotes causados por microorganismos comoEscherichia coli(Ejrnaes et al., 2006),salmonelaGénero (Olson et al., 1994),ShigelaGénero (Angelini et al., 2009),ListeriaGénero (Nascentes et al., 2012),CampylobacterGénero (Behringer et al., 2011), yVibrio cholerae,(Taneja et al., 2012) y más. La técnica se ha utilizado para identificar brotes de infección, detectar la transmisión cruzada de patógenos nosocomiales, determinar la fuente de infección, identificar cepas particularmente virulentas y monitorear programas de vacunación, entre otros (Olive & Bean 1999). Mediante inspección visual (Tenover et al., 1995) o usando software para analizar los patrones de PFGE, se pueden determinar las similitudes genéticas entre los aislados, lo que permite hacer inferencias sobre si dos aislados aparentemente no relacionados tienen el mismo origen evolutivo (Tenover et al., 1995, Nascentes et al. otros 2012).
Aplicaciones de la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) en estudios de epidemiología molecularListeria monocytogenes:PFGEListeria monocytogenesSe ha comparado con otros métodos de tipificación fenotípica y molecular en varios estudios (Giovannacci et al., 1999, Gravesen et al., 2000, Autio et al., 2003, Levin, 2003, Chung-Hsi et al., 2006) ; ha demostrado ser la técnica más discriminativa y reproducible en la mayoría de los casos. En estos estudios, se utilizó SID(Índice de diversidad de Simpson ó Índice de diversidad;Hunter y Gaston 1988), que se basa en la probabilidad de que dos cepas no relacionadas se coloquen en diferentes grupos de tipificación. Este índice se utiliza para comparar los métodos de tipeo de modo que se seleccione el método más discriminatorio.
Berlín et al. (1997) demostraron en su estudio que PFGE fue el método más discriminativo, seguido de REA, MEE(Electroforesis enzimática multisitio)Al final se realizó la serotipificación; Giovannacci et al. (1999), encontraron que la técnica RAPD mostró una discriminación mucho menor que la PFGE; Arnisalo et al. (2003), encontraron que el PFGE era más discriminativo que el ribotipado; Otio et al. (2003), utilizando PFGE, AFLP(polimorfismo de longitud de fragmento amplificado)Además de la combinación de las dos técnicas, se encontró que incluso el PFGE solo tenía un índice de discriminación más alto que la combinación de las dos técnicas; Borucki et al. (2004) encontraron que PFGE era más discriminante que la técnica MLST.(tipificación de secuencia multilocus)Al mismo tiempo, esto es superior a la ribotipificación; Lukinmaa et al. (2004), encontraron que la PFGE era más discriminatoria que la ribotipificación y la serotipificación; Fugit et al. (2007), se encontró que PFGE tiene un SID más alto que el ribotipado; Mamina et al. (2009), encontraron que PFGE era más discriminatorio que ribotipado y simultáneamente comparado con PCR-RFLP.(reacción en cadena de la polimerasa - polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción);Finalmente, Ward et al. (2010), encontraron que PFGE tiene mayor poder discriminatorio que MLGT.(genotipificación multilocus),La conclusión es que este enfoque es altamente discriminatorio. Sin embargo, a pesar de conocer métodos como MLVA(análisis de repetición en tándem de número variable de múltiples locus)y MLST son más discriminativos que PFGE (Revazishvili et al., 2004, Miya et al., 2008), y PFGE en su variante CHEF sigue siendo el método de diferenciación molecular más utilizadoListeria monocytogenes.
También se ha determinado la discriminación de PFGE-CHEF utilizando diferentes enzimas de restricción. paraListeria monocytogenesSe utilizaron las siguientes endonucleasas de restricciónQuéI,orden ascendenteI,SMAI,NoSoySSE8387I; donde, Howard et al. (1992), encontraron que NotI produce fragmentos grandes, lo que dificulta la determinación del tamaño molecular. Nakama y otros. (1998), encontró que Sse8387I es másQuéI,orden ascendenteSoySMA1. Resultados de discriminación entre enzimasQuéI,orden ascendenteSoySMAVaría mucho dependiendo de la fuente del aislado y su diversidad genética; sin embargo, se ha establecido que el uso de dos o más enzimas generalmente aumenta el poder discriminativo de PFGE (Levin 2003), y se han probado combinaciones de enzimas ApaI y AscI. Combinaciones reportadas por múltiples autores como las que muestran los mejores resultadosListeria monocytogenes(Graves y Swaminathan 2001).
Mostrar enzima (tablas 1) más comúnmente utilizado para la digestión deListeria monocytogenes,La mayoría de ellos, excepto Xbal, tienen secuencias de reconocimiento ricas en GC. genomamonocitosTiene un tamaño de 2,9 Mb y un bajo contenido de G-C (37,8%; Torres et al., 2005), por lo que se utilizan enzimas de restricción para cortar secuencias ricas en estos nucleótidos y digerir con Produce patrones PFGE (10 a 20) con Pocas bandas, fácil de analizar.
Anteriormente, el protocolo PFGE tomaba alrededor de 7 días, por lo que muchos investigadores prefieren usar técnicas más rápidas, aunque son menos discriminatorias; además, en tiempo de ejecución de electroforesis, temperatura de ejecución, concentración y pH de la solución, calidad del reactivo, enzima de restricción. Hay muchas diferencias en el voltaje utilizado en el programa.
En 2001, Graves y Swaminathan estandarizaron el protocolo de subtipificaciónListeria monocytogenesPor PFGE, los ajustes se realizaron utilizando células bacterianas obtenidas directamente de cultivos en placa, prelisadas con lisozima, lisadas durante 2 horas, utilizando agua precalentada y tampón TE (0,01 M Tris-EDTA, pH 8 ± 0,2), utilizando el menor tiempo de digestión con restricción enzimas y electroforesis utilizando SeaKem Gold Agarose (Lonza, Alphareta GA, EE. UU.), lo que redujo el tiempo para obtener un cultivo puro a 30 horas (Graves & Swaminathan 2001), lo que significa que el tiempo de proceso (83%) y una reducción significativa en los costos de prueba.
A través de esta estandarización, los resultados de las encuestas se comparan fácilmente y se genera una base de datos internacional. PulseNet es una red nacional de laboratorios de salud pública y agencias reguladoras de alimentos, coordinada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EE. UU.www.cdc.gov/pulsenetPulseNet se creó en Atlanta, EE. UU. en 1995 y una red en América Latina y el Caribe en 2004 para promover el uso de PFGE para la vigilancia epidemiológica y tipificación de patógenos para fortalecer los sistemas de vigilancia y respuesta de cada país y región en la que está presente. implementar. Los patrones se envían electrónicamente a la base de datos dinámica de los CDC y están disponibles para los participantes a pedido, lo que permite una rápida comparación de patrones.
Protocolos estandarizados por PulseNet:Las bacterias se cultivaron en placas de agar BHI a 37°C durante 16-18 horas. Transfiera las células de la placa de Petri a un tubo de plástico de 15 ml que contenga 3 ml de tampón 1X TE con un hisopo estéril y ajuste la densidad celular entre 0,79 y 0,81 con un nefelómetro. Transfiera la suspensión celular (~ 240 μ) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 60 μl de solución de lisozima de 10 mg/ml (Sigma, St. Louis, MO) y mezcle con pipeta. Incubar la mezcla en un baño de temperatura constante a 37 ° C durante 10 min. Después de este tiempo, un volumen igual de solución de agarosa SeaKem Gold al 1,2 % (p/v), dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 % (p/v), proteinasa K 0,2 mg/ml (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en agua destilada estéril, mantenida a 53-56 °C, seguida de pipeteo suave repetido. Divida la mezcla (600 l) en dos moldes reutilizables (300 l cada uno) (Bio-Rad, Hercules, CA) y enfríe durante 5 min. Transfiera el bloque de agarosa a una solución que contenga 4 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8,0 ± 0,2; EDTA 50 mM pH 8,0 ± 0,2; lauril sarcosina sódica al 1 % (p/v), proteasa K 0,15 mg/ml) en 50 mL tubos de plástico de polipropileno), incubar durante 2 h en un baño de temperatura constante entre 50 y 54 °C con agitación orbital a 200 rpm. Después de la proteólisis, decante el lisado y lave el bloque dos veces con 15 ml de agua destilada estéril precalentada (50-54 °C) durante 10 min cada una, luego cuatro veces con tampón 1X TE durante 15 min cada una Temperatura y condiciones de agitación descritas anteriormente . Una vez finalizado el proceso, corte el bloque de 2 a 2,5 mm con el accesorio de corte de gel. Los bloques se pueden almacenar a 4 ° C en 1,5 ml de tampón TE 1X hasta que se digieran.
Para la digestión de ADN de alto peso molecular (intacto y contenido en el bloque de agarosa), use enzimas.orden ascendenteI (New England BioLabs, Beverly, MA) o Apal (Roche Molecular Biochemicals) en solución tamponada según las instrucciones del fabricante de la enzima. límite conorden ascendenteI a una concentración de 25 U por bloque durante 3 h a 37 °C o con ApaI a una concentración de 160.200 U por bloque durante 5 h a 30 °C. Una vez completado el proceso de digestión, los bloques se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa SeaKem Gold al 1 % (p/v) en tampón Tris-borato-EDTA (TBE) 0,5X a 14 °C en una unidad PFGE. CHEF-Mapeador (Bole). La electroforesis se realizó durante 22 h con tiempos de pulso que oscilaron entre 4 y 40 s, un ángulo de 120°, un gradiente de 6 V/cm y una temperatura de 14°C. Posteriormente, el gel se tiñó en 250 ml de agua desionizada que contenía 25 μ de bromuro de etidio (10 mg/ml) durante 15-20 minutos, luego se lavó 3 veces con 500 ml de agua desionizada durante 20-30 minutos cada vez. El análisis de patrones se realizó utilizando el software Molecular Analyst Fingerprinting Plus (BioRad; Graves & Swaminathan 2001).
Es importante tener en cuenta las últimas actualizaciones de los Procedimientos Operativos Estándar de PFGEListeria monocytogenespor PulseNet (versión 2013;http://www.cdc.gov/pulsenet/PDF/listeria-pfge-protocol-508c.pdf; PulseNet 2013), considere la codigestión con AscI utilizando las enzimas de restricción XbaI y el material resultante debe digerirse nuevamente con ApaI. Esta actualización también recomienda el uso de albúmina sérica bovina (BSA) durante la restricción enzimática para minimizar la incidencia de restricción parcial.
Interpretación de la descripción general del PFGE:Diversos estudios han analizado visualmente los patrones producidos por electroforesis (Bille & Rocourt 1996, Dalton et al. 1997, Nakama et al. 1998, Aarnisalo et al. 2003, Gudmundsdóttir et al. 2005, Chiu et al. Lindstedt et al. 2008, Sauders et al. 2009, Kérouanton et al. 2010, Latorre et al. 2010), basado en los criterios de tipificación de cepas bacterianas propuestos por Tenover et al., (1995); si los dos patrones difieren en 2 a 3 bandas, son se considera que están estrechamente relacionados y es probable que las cepas sean parte del brote; si los dos patrones difieren en 4 Si los dos patrones difieren en 7 o más bandas, se consideran diferentes y, por lo tanto, no forman parte del brote. Sin embargo, el análisis visual ayuda a obtener resultados subjetivos, como lo demuestra la falta de concordancia entre los estudios (Birren & Lai 1993).
Tenover demostró efectivamente que la interpretación de las diferencias en el número de bandas entre un par de aislamientos permite agruparlos o no; sin embargo, este tipo de análisis estaría respaldado por un número mínimo de eventos mutacionales (por ejemplo, dos aislamientos Una diferencia en se consideraría que dos o tres bandas están estrechamente relacionadas con un solo evento genético), pero no siempre es así. Más recientemente, el CDC sugirió que los criterios de Tenover no son adecuados para la investigación de brotes derivados de alimentos porque los fenómenos de transferencia de genes, bandas superpuestas y otros artefactos pueden afectar la relación y la interpretación de los perfiles. (Comunicación personal Dr. José Antonio Lepe, Unidad Clínica de Enfermedades Infecciosas, Microbiología y Medicina Preventiva (Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, España). Según los nuevos criterios adoptadosListeria monocytogenesLas bandas diferenciales pueden considerarse importantes para distinguir los dos perfiles (Barrett et al. 2006). Por otro lado, la interpretación de los patrones de bandas de PFGE requiere muchas decisiones subjetivas, y dicha subjetividad aumenta la variabilidad del perfil, afectando así la forma en que se interpretan los resultados en la lectura visual (Gerner-Smidt et al., 1998).
Por otro lado, PulseNet desarrolló un protocolo para el análisis computarizado de perfiles PFGE hace varios años, utilizando el software BioNumerics para reemplazar las lecturas visuales, y aunque este protocolo se ha movido hacia la interpretación automática, algunas de sus mediciones obligan al usuario a tomar una decisión. Es crucial durante el análisis, especialmente para la asignación de bandas anormales y la interpretación de perfiles estrechamente relacionados; esta es una deficiencia importante de PFGE en la estandarización del protocolo (Gerner-Smidt et al., 2006).
Aunque el software se usa para analizar patrones, produce resultados más reproducibles, confiables y comparables. Estos procedimientos generalmente se basan en el índice de coincidencia de Dice (1945), que se calcula mediante la siguiente ecuación:
Dónde:pequeñoxyes la similitud entre las cepasXSídiscordiaxyes el número de bandas compartidas por los dos perfiles de ADN, ynorteXSínorteSíes el número de bandas que muestra la cepaX y Yrespectivamente.
La similitud también se puede determinar mediante el índice de Jaccard (1901) utilizado en el estudio de Zunabovic (Zunabovic et al., 2011), que se calcula mediante la siguiente ecuación:
Dónde:Aes el número de atributos presentes en la OTU (Unidad taxonómica operativa) A,Segundoes el número de atributos presentes en OTU B y C es el número de atributos comunes presentes en OTUASíSegundo(Real et al., 1997).
Finalmente, también se utiliza el coeficiente de Simpson para determinar la similitud entre cepas, que se calcula de la siguiente manera:
Dónde:Ces el número de bandas compartidas entre las dos cepas, yNoes el número de bandas para el patrón restringido, con el mayor número de bandas entre cada par coincidente (Proctor et al. 1995).
Estos indicadores para determinar la similitud tienen características comunes: fáciles de expresar, simples y directos de interpretar, el rango de expresión (matriz de similitud) oscila entre 0 y 1, permiten considerar posibilidades como la presencia de elementos excluyentes, sin categoría Pesos especiales y pesos especiales para determinadas clases (Saiz 1980, Foerster et al. 2013, Travouillon et al. 2013). De los estudios consultados para esta revisión, el 67% utilizó el índice de coincidencia de Dice (1945) y el 31,6% utilizó el índice de Jaccard (1901), el coeficiente de Simpson (Proctor et al. 1995) fue utilizado sólo por el 1,4%, razón por la cual el El primer método es claramente el método más común para encontrar similitudes entre los patrones de las cepas estudiadas.
Para generar el dendrograma se utilizó el método de cálculo UPGMA (Jain et al. 2000, Foerster et al. 2013), este es un algoritmo de agrupamiento jerárquico que consiste en buscar la menor distancia en la matriz de distancia genética y agrupar las celdas que forman en un solo taxón independiente. Por lo tanto, se promedian las celdas nuevas en relación con las celdas restantes, se genera una nueva matriz y se repite el proceso hasta que todas las celdas se unen a un solo elemento (ancestro hipotético; Jain et al., 2000). De esta manera se logra la elaboración de un dendograma basado en la similitud de los aislados, denominado dendograma. punto de corte(cortar)Utilizado para determinar la similitud entre clusters al 80% (Luizaga de Monteiro et al., 2013, Rivoal et al., 2013).
Los aislamientos se pueden clasificar por distancia genética mediante patrones de agrupación basados en dendrogramas de PFGE u otras técnicas moleculares.Listeria monocytogenesEn 3 grupos o genealogías genéticas. El linaje I corresponde a los serotipos V2b, 3b, 4b, 4d, 4e y 7; el linaje II corresponde a los serotipos 1/2a, 3a, 1/2c y 3c; y el linaje III incluye los serotipos 4a y 4c y algunos serotipos DICE 1945, Bille & Rocourt 1996, Olive & Bean 1999, Dauphin y otros 2001, Graves & SWAMINAN 2001, Nadon y otros 2002, CRUM en 2002, Larsen et al., Lukinmaa en 2002, Lukinmaa Equal 2004, Kérouanton et al.2010, Di Ciccio et al. 2012, Ferronatto et al. 2012). En los últimos años se ha informado de la existencia de un cuarto linaje (IV), identificado por primera vez mediante la técnica MLGT, compuesto por aislados obtenidos principalmente de rumiantes con los serotipos 4a, 4b y 4c, pertenecientes a las cepas del linaje III. que varían ampliamente entre los aislamientos (Orsi et al., 2011). Ninguno de los artículos revisados caracterizó la cepa.Listeria monocytogenesA través de PFGE (tabla 2) menciona el linaje IV, lo que sugiere que las enzimas utilizadas actualmente para PFGE todavía no permiten la distinción entre los miembros del linaje III y IV.
Para lograr la agrupación de genealogías, son necesarios el serotipado y los dendrogramas. Sin embargo, el origen de los aislamientos asociados con los serotipos puede proporcionar ideas tempranas sobre los linajes a los que podrían corresponder los aislamientos, ya que los linajes I y II generalmente se consideran los que contienen los serotipos más comúnmente asociados con los brotes. Las cepas en los alimentos, incluidos los serotipos 1/2a (linaje II) y los serotipos 1/2b y 4b (linaje I), las cepas del linaje II son comunes en alimentos, plantas, granjas y se han informado de casos de listeriosis en animales y aislados de casos humanos esporádicos (Torres et al 2004, Belalcazar et al 2005, Orsi et al 2011).
Por otra parte, las cepas de los linajes III y IV son raras y se aíslan principalmente de fuentes animales, principalmente de rumiantes y otros mamíferos no primates, por lo que se dispone de poca información sobre ellas, en ocasiones se aíslan de casos clínicos. et al. 2011, Tsai et al. 2011).
caracterizarListeria monocytogenesEn algunos países de los Estados Unidos por PFGE:En los EE. UU., EE. UU. y Canadá son los países que informan con más frecuencia brotes relacionados con el virusListeria monocytogenes(Torres et al. 2004, Warriner & Namvar 2009, Cartwright et al. 2013), esto se debe a sus sistemas de vigilancia, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Foodborne Disease Outbreak Surveillance System y Public Health Alert Center (PHAC)” Canadian Public Health Intelligence Network (CNPHI)" incluye respectivamente la caracterización a través de PFGE que alimenta el sistema PulseNet.
En un estudio retrospectivo de brotes de listeriosis en los Estados Unidos entre 1998 y 2008 (Cartwright et al., 2013), laListeria monocytogenesEn PulseNet; encontró un aumento de 9 veces en el número de informes de brotes de listeriosis atribuidos a más pruebas a través del programa (PulseNet). Por otro lado, el segundo período de estudio tuvo brotes generalmente más cortos y menos casos. Estos resultados demuestran que los controles aplicados por la industria y el seguimiento del programa PulseNet son efectivos. La información sobre la epidemiología y los brotes de listeriosis sigue siendo escasa en los países de América Latina porque la enfermedad no se diagnostica con frecuencia. Sin embargo, en los últimos años se ha utilizado PFGE para estudiar la presencia y persistencia de cepas (Vongkamjan et al., 2013)Listeria monocytogenesEn la industria de procesamiento de alimentos, detección de fuentes de contaminación y presencia de cepas persistentes para programas de limpieza y desinfección más efectivos (Brito et al. 2008, Cruz et al. 2008, Sequeira Mendonça 2009, von Laer et al. 2009, Nascentes Galvão et al. 2012).
En Brasil (Lemes-Marques et al., 2007), se utilizaron dendrogramas con PFGE y serotipificación para clasificar los aislamientosListeria monocytogenesen tres grupos; desafortunadamente, no se pudo identificar la fuente de exposición microbiana para los 12 casos clínicos evaluados, y no se pudo establecer una relación definitiva entre los aislamientos debido a la ausencia de datos epidemiológicos previos. En Chile, (Cordano & Jacquet 2009), usando PFGEListeria monocytogenesEl patrón PFGE encontrado en ensaladas de vegetales frescos y congelados preparados y vendidos en supermercados en Santiago de Chile (Foerster et al., 2012) nos permitió detectar aislados de aves de corral de tiendas locales aislados de pacientes con relación de listeriosis entre cepas.
En un estudio realizado en Argentina (Laciar & Centorbi 2002), PFGE permitió distinguir entre cepas del mismo serotipo y cepas que parecían ser similares. PFGE es más discriminatorio que la serotipificación y permite la caracterización de todas las cepas, incluso aquellas que no pueden ser tipificadas por fagos. Este estudio muestra que hayListeria monocytogenesMuestras de mariscos de la costa atlántica argentina.
Prevalencia, tipos y distribución geográfica de cepas en MéxicoListeria monocytogenesaislado de queso fresco (Moreno-Enríquez et al., 2007). En esta investigación se encontró que de una misma muestra se pueden encontrar diferentes tipos de frijol, lo que puede indicar diferentes fuentes de contaminación y mayor riesgo para los consumidores. A la fecha, en Colombia no se han publicado estudios utilizando PFGE como herramienta de tipificación molecular.Listeria monocytogenes;Sin embargo, esta técnica se ha utilizado durante más de una década en estudios epidemiológicos de otros microorganismos comoPseudomonas aeruginosa(Garzón 2000),Shigella flexneri(Hidalgo et al., 2002),Klebsiella pneumoniae(Espinal et al. 2004, Mantilla et al. 2006),steotococos neumonia(Moreno et al., 2004),salmonelaTifoidea murina (Muñoz et al. 2006),Salmonella typhi(Cardona-Castro et al., 2007),Acinetobacter baumannii(Yomayusa et al. 2008), yEscherichia coli(Gaitán C et al., 2009). Es necesaria la implementación de la técnica PFGE en el país para generar datos epidemiológicos, prevalencia y persistencia de cepas epidemiológicasListeria monocytogenesComprender las fuentes de transmisión y desarrollar medidas de control en la industria de procesamiento de alimentos para reducir el riesgo de contraer listeriosis por el consumo de alimentos contaminados. Por otro lado, el proyecto que apoya esta revisión propone entre sus objetivos la caracterización molecular por PFGE (variante CHEF)Listeria monocytogenesLos resultados del estudio, siguiendo los indicadores técnicos de PulseNet, se obtienen de manera que los resultados sean comparables y útiles para el gobierno y la industria.
en conclusión
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es la técnica molecular estándar de oro para tipificar y diferenciar aislamientos.Listeria monocytogenes,Porque es una técnica altamente discriminativa con resultados reproducibles, rápida ejecución y comparación. PFGE permitió la separación de los aislamientos en tres linajes de serotipos, aunque puede que no sea posible distinguir entre el linaje III y el linaje IV como lo informaron otros autores. variante COCINERO(campo eléctrico uniforme sujeto al contorno)es el único que se utiliza para clasificarListeria monocytogenes.combinación de enzimas de restricciónorden ascendenteSoyQuéLos I se usan más comúnmente porque producen una mayor discriminación en la técnica; sin embargo, en la actualización de 2013 del protocolo PulseNet, se recomendó usar la codigestión XbaI-AscI seguida deQuéI. Los mejores protocolos PFGE para la tipificación molecularListeria monocytogeneses el estandarizado para PulseNet por Graves y Swaminathan (2001). Sin embargo, las condiciones deben estar estandarizadas para cada laboratorio. En Colombia (es decir) no hay trabajos publicados sobre caracterización molecularListeria monocytogenesPor PFGE, esto contrasta fuertemente con el hecho de que la notificación de este microorganismo en los alimentos aún no es obligatoria, así como el infradiagnóstico existente de este patógeno. Por otro lado, en América Latina se debe expandir el uso de esta tecnología para generar bases de datos para mejorar la vigilancia y el conocimiento de los clones existentes y sus orígenes en cada país, y desarrollar medidas de control basadas en evidencia.
Finalmente, está claro que las técnicas moleculares como MLVA y MLST han demostrado una mayor capacidad para detectar la variación dentro de los serotipos y diferenciar los aislamientos.Listeria monocytogenes;Sin embargo, la mayoría de los investigadores utilizan PFGE estandarizados por PulseNet para que sus resultados puedan compararse globalmente y contribuir al conocimiento de la epidemiología de la listeriosis.
Gracias
Este trabajo se enmarca en el proyecto "Diseño de un programa integral para reducir la prevalencia desalmonelaespeciesListeriaPlantas de proceso, despiece y puntos de venta en la cadena porcina”, financiado por Colciencias y ejecutado en cooperación con Asoporcicultores-FNP-CENIPORCINO (Proyecto N° 120358635758). Registrado en la Vicerrectoría de Investigación de la Pontificia Universidad Javeriana (N° 0005386 ).
conflicto de intereses
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses con este trabajo ni con ninguna marca existente que pueda proporcionar reactivos con especificaciones similares. Asimismo, las marcas comerciales mencionadas en este texto solo se utilizan para demostrar con precisión la forma estandarizada del protocolo PulseNet.
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